非小細胞肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的 惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康。手術(shù)治療是目前 治療早期非小細胞肺癌最有效的手段，但由于肺癌的早期癥狀不明顯，很大一部分患者在確診非 小細胞肺癌時已發(fā)生轉(zhuǎn)移。對于這些患者而言， 系統(tǒng)性化療是不可或缺的治療方案。

1 材料

1.1 細胞培養(yǎng)

人非小細胞肺癌細胞系 A549 購于美國模式 培養(yǎng)物保存中心(ATCC)，培養(yǎng)在含 10%胎牛血清 的 DMEM 培養(yǎng)基中，在 37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海一恒LHS-50CH恒溫恒濕培養(yǎng)箱）中培養(yǎng) 并通入 5% CO2。細胞每 2~3 d 傳代 1 次，傳代時， 用胰酶消化液使細胞進入懸浮狀態(tài)，并用 DMEM 培養(yǎng)基洗滌 2 次，將細胞懸液按 1∶3 稀釋后傳代。

1.2 試劑

順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、噻唑藍(MTT)和凋亡 檢測試劑盒購于德國 Sigma-Aldrich(批號分別為 C221000，1096407，O9512，M2128，APOAF)； YM-155(美國 Med Chem Express 公司，批號： HY-10194)；DMEM 培養(yǎng)基(美國 Gibco，批號： 10569044)；蛋白提取液、survivin、細胞色素 C、 凋亡誘導因子、caspase-9、caspase-3 和 GAPDH 抗體購于美國 Cell Signaling(貨號分別為#9806， #2808，#4280，#5318，#9502，#9665，#5174)； 線粒體分離試劑盒和 JC-1 購于碧云天生物科技有 限公司(批號：C3601，C2005)；ECL 顯色試劑盒(美 國 Pierce，批號：32106)；Lipofectamine 2000(美 國 Invitrogen，批號：11668019)。survivin 小干擾 RNA(美國 Santa Cruze 公司，批號：SC-29499)。

2 方法

2.1 survivin 強制過表達與基因沉默

將 survivin 基因的開放閱讀框架序列經(jīng) PCR 擴增后，以分子克隆的方法與 pcDNA3.1 連接后構(gòu) 建成 survivin 重組質(zhì)粒，用于在 A549 細胞進行 survivin 的強制過表達。survivin siRNA 則用于 survivin 的基因沉默。A549 細胞接種在 6 孔板中 孵育過夜使之貼壁。將 survivin 重組質(zhì)粒(終濃度為 2 μg·mL??) 或 survivin siRNA( 終濃度為 50 pmol·mL??)用 Lipofectamine 2000 進行包裹后， 將其加入到無血清培養(yǎng)基進行混合。將貼壁的 A549 細胞置于該無血清培養(yǎng)基孵育 6 h，之后棄 去無血清培養(yǎng)基加入新鮮的含 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 h。收集細胞用于后續(xù)實 驗。對照細胞為 Lipofectamine 2000(含空質(zhì)粒，終 濃度為 2 μg·mL??)，孵育 6 h。

2.2 細胞活力、半抑制濃度(IC50)與兩藥聯(lián)合指數(shù) (combination index，CI)檢測

將 A549 細胞按每孔 5×103 接種在 96 孔板上， 孵育過夜，使之貼壁。在培養(yǎng)基中加入順鉑 (0~30 ?mol·L??) 和 YM-155(0~80 nmol·L??) 處 理 A549 細胞 48 h。之后在每個培養(yǎng)孔中加入 0.1 mg MTT，并將細胞繼續(xù)置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 h。小心吸走孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入 100 ?L 二甲亞砜， 充分震蕩混勻后在 570 nm 波長下測定吸光度(A) 值。細胞活力結(jié)果用藥物處理組與對照組的 A 值 比值表示。繪制細胞活力-順鉑濃度曲線，根據(jù)曲 線計算順鉑對 A549 細胞的 IC50。CI 用以下公式判 斷：CI=E(A+B)/(EA+EB?EA×EB)，其中 E(A+B) 為合并用藥抑制率，EA 和 EB 分別為順鉑和 YM-155 的抑制率。CI 在 0.85~1.15 內(nèi)為兩藥作用 單純相加，CI>1.15 為協(xié)同作用，CI<0.85 為拮抗 作用。藥物抑制率=(A 對照組?A 藥物處理組)/A 對照組×100%。

3 結(jié)果

將非小細胞肺癌細胞系 A549 用 YM-155 (0~80 nmol·L??)進行單獨處理，MTT 試驗結(jié)果顯 示，10 nmol·L?? YM-155 單獨處理僅能輕微抑制 A549 細胞的細胞活力。因此將 A549 細胞用 10 nmol·L??的 YM-155 與不同濃度順鉑進行聯(lián)合 處理，研究 YM-155 是否能增強順鉑的抗肺癌活 性。實驗結(jié)果顯示，YM-155 10 nmol·L??聯(lián)合處理 能顯著提高不同濃度順鉑(1~30 ?mol·L??)對非小 細胞肺癌細胞系 A549 的殺傷活性。根據(jù)細胞活力 -順鉑濃度曲線計算順鉑對 A549 的 IC50，結(jié)果發(fā) 現(xiàn) YM-155(10 nmol·L??)協(xié)同處理能明顯降低順鉑 對 A549 細胞的 IC50，結(jié)果見圖 1。另外，將 A549 用順鉑(1~20 ?mol·L??)和 YM-155 (5~100 nmol·L??) (順鉑∶YM-155=200∶1)進行聯(lián)合處理，計算 CI 值，結(jié)果顯示順鉑和 YM-155 存在協(xié)同抗非小細胞 肺癌活性，見表 1。

Western blot 試驗結(jié)果顯示，YM-155 能明顯 抑制 A549 細胞中 survivin 的表達水平，表明 survivin 是 YM-155 的作用靶點。另外，為了研究 survivin 對順鉑殺傷非小細胞肺癌活性的影響，將 survivin 表達質(zhì)?；?survivin siRNA 轉(zhuǎn)染入 A549 細胞中，觀察其效果，survivin 質(zhì)粒和 survivin siRNA 的轉(zhuǎn)染效率。MTT 試驗結(jié)果顯示， YM-155 能顯著提高順鉑對 A549 細胞的殺傷活性， 然而轉(zhuǎn)染 survivin 表達質(zhì)粒后，YM-155 對順鉑抗 肺癌活性的增強作用受到明顯抑制。另一方面， 轉(zhuǎn)染 survivin siRNA 直接抑制 survivin 的表達水平 同樣能增強順鉑對 A549 細胞的毒性。同時，在 YM-155 處理的 A549 細胞中轉(zhuǎn)染 survivin siRNA 能進一步增強順鉑對 A549 細胞的毒性。這些結(jié)果 表明 survivin 對順鉑的抗肺癌活性起重要作用， YM-155 是通過抑制 A549 細胞中 survivin 的表達 提高其對順鉑的敏感性。

4 討論

YM-155 是一種 survivin 特異性抑制劑，臨床 試驗和基礎(chǔ)實驗表明 YM-155 是一種潛在的抗腫 瘤協(xié)同治療藥物，對多西他奇、美羅華、雷帕霉 素等抗腫瘤藥物的療效都有增效作用。然而， YM-155 如何增強化療藥物的療效，其下游機制 如何，目前仍不清楚。另外，盡管順鉑是治療非 小細胞肺癌的一線藥物，然而順鉑對患者的不良 反應也較大，因此采取協(xié)同治療手段降低順鉑的 使用劑量并提高其療效是目前肺癌化療的重要策略。



 

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