白色念珠菌（Canidia albicans）一種條件治病真 菌，當(dāng)機(jī)體免疫功能下降時(shí)，白色念珠菌將大量繁殖 入侵機(jī)體細(xì)胞導(dǎo)致疾病發(fā)生 。菌群與上皮細(xì)胞表 面的受體結(jié)合并分泌出胞外多糖或蛋白，形成的膜 狀物，即生物膜。與浮游細(xì)胞相比，生物膜將自身包 裹在自發(fā)粘附的多糖和蛋白質(zhì)層中，使白色念珠菌 粘附到表面，可防治藥物的殺菌作用 ，具有抵抗更 高水平的抗真菌劑的能力，并且可以產(chǎn)生對(duì)常用治 療的耐受性 。生物膜的形成是白色念珠菌產(chǎn)生耐 藥性的主要原因之一 。因此，篩選生物膜抑制劑的 研究方向具有很大意義。

高速冷凍離心機(jī)，高壓滅菌鍋，電子天平，96 孔 板，恒溫振蕩儀，酶標(biāo)儀

致病菌株：白色念珠菌 ATCC 64550（Canidia al? bicans ATCC 64550），購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 ATCC。拮抗菌株：放線菌菌株 TRM43355 分離于新 疆阿拉爾市塔克拉瑪干沙漠的流動(dòng)風(fēng)沙。

高氏一號(hào)培養(yǎng)基（1 L）；AM6 培養(yǎng)基（1 L）；YPD 培養(yǎng)基；SDB培養(yǎng)基，培養(yǎng)見(jiàn)《微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》。 試劑：(NH4)2SO3；CuSO4·5H2O；FeSO4·7H2O；Mn? SO4·H2O；ZnSO4·7H2O；CH3OH。

TRM43355 的分類(lèi)學(xué)鑒定 根據(jù)張仁文等報(bào)道的用酶解法提取鏈霉菌基 因組總DNA并進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，并委 托上海生物工程有限公司測(cè)序。使用 EzTaxon 數(shù)據(jù) 庫(kù)與來(lái)自最密切相關(guān)的鏈霉菌屬物種的序列進(jìn)行多 重比對(duì)，以及序列相似性的計(jì)算。通過(guò) MEGA 軟件 中 鄰 接 法（Neighbor - Joining，NJ）構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹(shù) ，明確其分類(lèi)學(xué)地位。

將放線菌菌株 TRM43355 接種于高氏一號(hào)固體 培養(yǎng)基于 37 ℃培養(yǎng) 5-7 d。將單菌落接種于 AM6 液 體發(fā)酵培養(yǎng)基，每瓶 150 mL，37 ℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng) 7-10 d。發(fā)酵液用紗布過(guò)濾，除去大顆粒的菌體， 再用 50 mL 離心管，10000 r/min 離心 10 min，以備后 續(xù)使用。

將發(fā)酵液分別通過(guò)D-101大孔樹(shù)脂吸附 ，分別 用 30 %、50 %、70 %、95 %甲醇洗脫，收集不同階段 組分，膏狀 50 ℃烘干備用。稱(chēng)取適量浸膏用 5 % DMSO溶解，過(guò)0.22 µm無(wú)菌微孔濾膜，-20 ℃待用。

將放線菌菌株 TRM43355 的發(fā)酵液用紗布過(guò)濾 后，10000 r/min 離心 10 min，收集上清，再按 70 %的 濃度加入飽和硫酸銨 ，置于攪拌 30 min，4 ℃靜置 過(guò)夜，10000 r/min 低溫高速離心 15 min，收集沉淀。 用少量 PBS（磷酸鹽緩沖液）溶解沉淀，用 MW8000- 10000 的透析袋4 ℃透析48 h。奈氏試劑檢測(cè)透析液 中的 NH4+ 是否殘留。將無(wú)殘留 PBS溶解的粗蛋白溶 液冷凍抽干，存放-20℃?zhèn)溆谩?/span>

采用微孔板半定量方法 檢測(cè)蛋白對(duì)念珠菌生 物膜形成能力的影響。用 PBS 配制蛋白母液濃度為 2 mg/mL，經(jīng)過(guò) 0.22 µm 微孔濾膜過(guò)濾，置于 96 孔板 中，進(jìn)行倍性稀釋?zhuān)@得蛋白濃度為 1000~3.91 μg/ mL 檢測(cè)不同蛋白濃度對(duì)白色念珠菌生物膜形成 能力的影響。

取 100 μL 的菌株 TRM43355 發(fā)酵液分段產(chǎn)物溶 液（30 %、50 %、70 %、95 %不同甲醇相組分浸膏）和 100 μL 的菌液（將培養(yǎng) 72 h 白色念珠菌菌液按 1:10 稀釋?zhuān)簼舛葹?1.205×107 CFU/mL）加至 96 孔板 中，混勻，4 個(gè)孔為一組平行實(shí)驗(yàn)。37℃培養(yǎng)箱靜置 培養(yǎng) 72 h 后用酶標(biāo)儀檢測(cè)生物生長(zhǎng)量，蒸餾水沖洗 三次，洗去未黏附的浮游真菌，60 ℃烘箱1 h，用0.5% 結(jié)晶紫染色5 min，用蒸餾水沖洗后室溫下自然晾干， 用酶標(biāo)儀測(cè)定ATCC 64550白色念珠菌生物膜形成能 力，相對(duì)生物膜形成能力=（處理組 OD490/空白對(duì)照OD490）×100。

TRM 43355經(jīng)過(guò)16S rRNA基因序列比對(duì)分析結(jié) 果表明此菌株屬于鏈霉菌屬，與數(shù)據(jù)庫(kù)中Streptomyces barkulensis RC 1831T 具 有 最 高 相 似 性 ，相 似 度 為 99.06%。與其它鏈霉菌屬種親緣關(guān)系如圖1所示。

使用微孔板半定量法檢測(cè)發(fā)酵液的提取物對(duì)白 色念珠菌ATCC 64550生物膜形成的影響。菌株 TRM 43355 的粗蛋白對(duì)白色念珠菌生物膜 形成具有很好的抑制效果，抑制率高達(dá) 88.12 %，其 70 %、95 %甲醇洗脫分子的活性也比較顯著。后續(xù) 實(shí)驗(yàn)就放線菌 TRM 43355發(fā)酵液中的粗蛋白深入研 究。為了確定菌株 TRM 43355 發(fā)酵液中蛋白對(duì)白色 念珠菌生物膜形成的最小抑膜濃度，用不同濃度蛋 白，采用微孔板定量法測(cè)試活性。粗蛋 白濃度為 2 mg/mL 時(shí)對(duì)白色念珠菌生物膜形成抑制 率為 93%。當(dāng)?shù)鞍诐舛?0. 25 mg/mL、0. 5 mg/mL 和 1 mg/mL 時(shí)相對(duì)生物膜形成能力分別為 96. 31 %、 82. 98 %和86. 89 %，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?2 mg/mL、2. 5 mg/ mL 和 3 mg / mL 時(shí) 相 對(duì) 生 物 膜 形 成 能 力 分 別 為 6. 48 %、7. 71 %和 7. 75 %；蛋白濃度為 0. 25 mg/mL、 0. 5 mg/mL和1 mg/mL時(shí)幾乎不能達(dá)到抑制生物膜的 效果，蛋白濃度為 2 mg/mL、2. 5 mg/mL 和 3 mg/mL 時(shí) 抑制生物膜的效果較好，抑制率可達(dá)90 %以上，因此 不同的蛋白濃度對(duì)白色念珠菌生物膜形成影響較 大，蛋白濃度越高生物膜形成能力越弱，抑制率越 強(qiáng)；濃度為 2 mg/mL 的蛋白濃度為最佳，繼而后續(xù)活 性測(cè)試都采用蛋白濃度為2 mg/mL。

上海一恒通過(guò)上述分析得出生物膜起到屏障保護(hù)作用，使藥物很難作用菌 群，因此生物膜的形成是白色念珠菌產(chǎn)生耐藥性主 要原因之一。白色念珠菌對(duì)大部分抗真菌藥物產(chǎn)生 多重耐藥性，這些使得白色念珠菌感染對(duì)人類(lèi)健康 產(chǎn)生更大的威脅。為了發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)低毒性和高治療 活性的新型抗真菌劑，專(zhuān)家們?cè)噲D從天然產(chǎn)物（植 物，動(dòng)物，微生物）中尋找。例如植物來(lái)源的姜黃 素 ，厚樸酚 ，和厚樸酚 ，檸檬烯 等對(duì)白色念 珠菌生物膜的形成具有較好的抑制作用；動(dòng)物來(lái)源的蛙皮抗菌肽- S1 可抑制白色念珠菌生物膜的形 成 ；微生物來(lái)源的土壤鏈霉菌菌株 98％乙醇提取 物 ，冠霉素鏈霉菌 ADP4 乙酸乙酯粗提取物 、海 洋 細(xì) 菌 枯 草 芽 孢 桿 菌 的 5 - 羥 甲 基 - 2 - 糠 醛 （5HM2F） 、糞腸球菌細(xì)菌素 EntV 等對(duì)白色念珠 菌的生物膜也具有較好的抑制效果。天然衍生的化 學(xué)抗真菌劑是一種有吸引力的選擇，特別是那些微 生物衍生的分子，由于它們對(duì)機(jī)體的刺激性小，毒性 小，同時(shí)也不易使病原菌發(fā)現(xiàn)采取防護(hù)措施。目前 開(kāi)發(fā)的大部分抗生素都源于放線菌，它被廣泛認(rèn)為 是新抗生素產(chǎn)生菌群的重要菌種，是開(kāi)發(fā)價(jià)值相當(dāng) 高的一類(lèi)微生物。



 

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