在中性或中等酸性土壤中，Al 主要以不 溶性沉積物的形式存在。但在酸性土壤 （pH<5.0）中，Al 以 Al3+、Al(OH)2+和 Al(OH)2 + 等形式被溶解釋放到土壤溶液，從而抑制根系 的生長，減少水分和養(yǎng)分的吸收，導(dǎo)致作物減 產(chǎn)。因此，Al 毒是酸性土壤中作物產(chǎn)量的主 要限制因素。茶樹適宜生長在 pH 為 4.5~5.5 的酸性土壤中，作為一種 Al 超富集植物，其 體內(nèi) Al 含量是其他植物的幾十到幾百倍，且 不表現(xiàn)毒害癥狀，適宜濃度的 Al 能明顯促進(jìn) 茶樹生長。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

供試材料為福鼎大白茶生長良好、大小一 致的一年生扦插苗，茶苗由湖北大悟縣半兵衛(wèi) 茶業(yè)有限公司提供。2018 年 3—8 月，試驗(yàn)培 養(yǎng)箱采用 40.0 cm×30.0 cm×15.0 cm 的藍(lán)色不 透明塑料箱，箱蓋帶有 20 個(gè)獨(dú)立開孔，每孔 放入 1 株茶苗，用海綿固定，培養(yǎng)室光照強(qiáng)度 ＞450 μmol·m-2；溫度(22~25)℃，16 h 光照/8 h 黑暗，空氣濕度 65%~85%。先用純蒸餾水預(yù) 培養(yǎng) 3 d。隨后移至營養(yǎng)液中。營養(yǎng)液參照文 獻(xiàn)的配方，用 0.1 mol·L-1 H2SO4 或 NaOH 調(diào) pH 至 5.0，每隔 7 d 更換 1 次營養(yǎng)液并持續(xù)通 氣。待茶苗長出大量白色吸收根后用于后續(xù) Al 處理。Al 處理采用 A12(SO4)3·18H2O，設(shè)置 0、0.2、1、2、4 mmol·L-1 5 個(gè) Al3+濃度，各 組重復(fù) 3 次。處理 7 d 后，取每盆 5 株茶樹幼 根于液氮速凍，作為 1 個(gè)重復(fù)樣，然后置于–80℃ 冰箱保存，備用。

1.2 抗氧化酶活性測定

采用南京建成生物工程研究所的總超氧 化物歧化酶（T-SOD）測試盒（羥胺法）、過 氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（可見光法）、 過氧化物酶（POD）測定試劑盒（比色法）、 抗壞血酸過氧化物酶（APX）測試盒（紫外比 色法），根據(jù)試劑盒提供的說明測定茶樹根系 總 SOD、CAT、POD、APX 4 種抗氧化酶活 性，3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 Al 含量測定

Al 含量測定參考王敏等方法。取液氮磨 碎的鮮樣 0.4 g 至玻璃消化管，依次加入 5 mLHNO3 與 2 mL HClO4，蓋上蓋子，60℃預(yù)消煮 2 h 后，120℃消煮至消煮液無色澄清透明，冷 卻后，用雙蒸水稀釋至 50 mL。取 10 mL 使用 ICP-OES（電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法） 測定 Al 元素的含量，每個(gè)處理 3 次生物學(xué)重 復(fù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用 1%稀硝酸將 Al 標(biāo)準(zhǔn)儲 備液（國家有色金屬及電子材料分析測試中心） 逐級稀釋為 0、5、10、30、40、50 µg·mL-1， 儀器自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 總 RNA 提取、cDNA 文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組

測序 每個(gè)處理 3 次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重 復(fù)由 5 株茶樹根系混合而成。采用改良的 CTAB 法提取茶樹根系總 RNA，Nanodrop 檢測 RNA 濃度，1%的瓊脂糖電泳檢測 RNA 完整性，Labchip 對 RNA 精確質(zhì)檢。質(zhì)檢合 格后送武漢博越致和生物科技有限公司構(gòu)建 RNA-Seq 文庫，并在 Illumina Hiseq Xten 平臺 上進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)質(zhì)控及過濾

測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識 別（Base calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列 （Raw reads），結(jié)果以 FASTQ 文件格式存儲， 其中包含測序序列（Reads）的序列信息及其 對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。Raw reads 經(jīng)過濾去除 接頭序列和低質(zhì)量序列得到獲得純凈 reads （Clean reads）。

1.6 參考序列比對分析

采用 Hisat2 軟件，以茶樹基因組作為 參考基因組，將 clean reads 比對到參考基因組 序列，使用 Hisat2 軟件，參考基因組選 “C.sinensis.genome.fa”文件，注釋文件選擇 “C.sinensis.gene.gtf”文件，對測序得到的 reads 比對情況做出評價(jià)。本研究所有基因注 釋 ID 都以茶樹基因組基因 ID 表示。

1.7 差異表達(dá)基因的篩選和功能注釋

采用 FPKM 值（Fragments per kilo basesper million mapped reads，代表每百萬 reads 中 來自于某基因每千堿基長度的 reads 數(shù)）來反 映基因的表達(dá)量。采用 DESeq2 表現(xiàn)基因的 讀段數(shù)在不同生物學(xué)個(gè)體之間的差異。在 DESeq2 的統(tǒng)計(jì)結(jié)果中，通過差異倍數(shù)和 FDR（False discover rate）≤0.05 為篩選條件，在 3 個(gè)轉(zhuǎn)錄組比較 組合中（R1 VS R0，R4 VS R0，R4 VS R1） 篩選差異表達(dá)基因。對找到的差異表達(dá)基因利 用 EggNOG 數(shù)據(jù)庫（http://eggnogdb.embl.de） 和 emapper 工具進(jìn)行 GO 注釋，獲得基因的 Orthologous groups，然后用 R 語言的 phyper 函數(shù)進(jìn)行超幾何分布檢驗(yàn)。以 Q-value≤0.05 為閾值定義差異表達(dá)基因中顯著富集的 GO terms。采用R語言的clusterProfiler包進(jìn)行KEGG （Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富 集分析，確定差異表達(dá)基因參與的代謝途徑。

1.8 差異表達(dá)基因熒光定量

PCR 驗(yàn)證 隨機(jī)選取 8 個(gè)差異表達(dá)基因，利用 Primer Premier 6 軟件設(shè)計(jì)引物（表 1），將 1.4 章節(jié) 中提取的 RNA 采用 cDNA 第一鏈合成試劑盒 （杭州新景）反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以 cDNA 為模 板，CsGAPDH 為內(nèi)參，采用 2×SYBR Green PCR Mix 試劑盒（杭州新景），在 ABI 7500 Fast 熒光定量 PCR 儀（ABI 公司，美國）上進(jìn)行 熒光定量檢測。每個(gè)樣品設(shè) 3 次技術(shù)重復(fù)，依 照 C T - 2 ?? 法計(jì)算相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

植物遭受逆境脅迫時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生活性氧，引 起膜脂過氧化和膜系統(tǒng)損傷，而抗氧化酶可清 除植物體內(nèi)的活性氧，且不同酶對逆境有不同 的響應(yīng)。由圖 1 可知，無 Al3+時(shí)根系 POD 活 性顯著高于其他 Al3+濃度下 POD 活性，且隨 著 Al 濃度的升高，根系 POD 活性逐漸下降。 SOD 活性在 Al3+濃度為 1 mmol·L-1 時(shí)最高，其 他處理無顯著差異。APX 活性隨著 Al3+濃度的增加逐漸升高。不同 Al3+濃度處理下茶樹根 系 CAT 活性無顯著差異。測序原始數(shù)據(jù)堿基組成基本平衡，并且堿 基百分比（Q30）大于 92%。充分說明測序得 到的數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可滿足后續(xù)分析。9 個(gè)樣 品共得到 3 137.9 萬~4 292.6 萬對 100 bp 的 reads，將包含測序接頭和低質(zhì)量 reads 去除后， 得到 1 984.2 萬~4 154.3 萬對 clean reads，占原 始序列的 93.5%~98.0%。與茶樹基因組進(jìn)行基 因序列比對，從比對結(jié)果來看（表 2），R0、 R1、R4 平均分別有 67%、69%和 67%的 reads 能有效地比對到參考序列上，成功注釋到參考 基因的 unique reads 占總 reads 的比例依次為50.1%、47.0%和 46.4%。

3 討論

上海一恒認(rèn)為應(yīng)用 RNA-Seq 技術(shù)對茶樹無 Al3+ （0 mmol·L-1，R0）、適宜 Al3+（1 mmol·L-1， R1）和高 Al3+（4 mmol·L-1，R4）濃度處理下 的根系轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較分析，獲得了大量差 異表達(dá)基因。GO 功能富集分析顯示這些差異 表達(dá)基因所參與的生物學(xué)過程主要包括刺激 和脅迫響應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等過程。差異表達(dá) 基因的分子功能主要包括核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、 果膠酯酶、氧化還原以及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等功能。差 異表達(dá)基因的 Pathway 顯著性富集分析進(jìn)一 步表明差異基因廣泛涉及轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、 植物-病原菌互作、苯丙烷生物合成等生物學(xué) 路徑。