貓爪草( Ｒadix ranunculi ternati) 為毛茛科植物小 毛茛( Ｒanunculus ternatus Thunb．) ，是中國的傳統(tǒng)中 藥，其味甘、辛，性溫，具有清熱、解毒、散結消瘀之功 效。貓爪草含有多糖、皂苷、黃酮類、生物堿類、氨基 酸等多種活性成分，具有調節(jié)免疫、抗氧化、抑菌、抗 腫瘤等作用，是目前唯一上市的抗結核中藥。當 前，貓爪草由于生長周期長，且野生資源不規(guī)范采挖， 栽培品種退化嚴重，次生代謝產物的含量不穩(wěn)定等因 素，致使藥材的產量和質量有所下降。

1 材料

1. 1 貓爪草樣品

長勢健康、株高約 20 cm 的未開花貓爪草植株， 采自信陽農林學院校區(qū)藥用植物園，采樣時將整株植 物拔出，帶至實驗室后立即進行內生真菌的分離。

1. 2 供試病原菌

病原細菌: 大腸桿菌( Escherichia coli) 、金黃色葡 萄 球 菌 ( Staphylococcus aureus ) 、沙 門 氏 桿 菌 ( Salmonella enterica) ，均由信陽農林學院生物與制藥 工程學院微生物實驗室保存。 病原真菌: 禾谷鐮孢菌( Fusarium graminearum) 、 核盤菌( Sclerotinia sclerotiorum) 、灰葡萄孢菌( Botrvtis cinerea) 及球黑孢菌( Nigrospora sphaerica) ，均由信陽 農林學院農學院植物病理實驗室提供。

1. 3 主要試劑

無水乙醇、葡萄糖、瓊脂粉等，均購自天津市科密 歐化 學 試 劑 有 限 公 司; CTAB ( C8440 ) 、氨 芐 西 林 ( 0339) ，購自北京索萊寶生物科技有限公司; 引物 ITS4、ITS5，均均由南京金斯瑞生物科技有限公司合 成; DNA 凝膠純化回收試劑盒、dNTP、Taq DNA 聚合 酶等，均購自天根生化科技( 北京) 有限公司。

1. 4 主要儀器

生化培養(yǎng)箱( 型號為一恒LＲH-150) ，購自上海一恒 科技有限公司; 智能恒溫培養(yǎng)振蕩器( 型號為 HNY－ 200B) ，購自天津歐諾儀器股份有限公司; 旋轉蒸發(fā)儀( 型號為 ＲE－522AA) ，購自上海亞榮生化儀器廠; 全自動高壓滅菌鍋( 型號為 YXQ－75S II) ，購自北京勤誠盛達科學儀器有限公司; 超凈工作臺( 型號為 SW－CJ－2G) ，購自上海蘇凈實業(yè)有限公司。

2 方法

2. 1 內生真菌的分離純化

將采集的新鮮貓爪草先用自來水沖洗干凈，濾紙 吸干水分，轉至超凈工作臺; 75%乙醇浸泡 1 min，用 無菌水沖洗 1 次; 再放入 0. 1% 升汞溶液中 5 min， 75%乙醇浸泡 1 min，用無菌水沖洗 5 次，無菌濾紙吸 干。用無菌刀將根、莖切成 0. 5 cm 小段，葉子切成 0. 5 cm×0. 5 cm 小塊，分別置于含有 100 U /mL 青霉 素的 PDA 培養(yǎng)基中進行內生真菌的分離，取 200 μL 無菌水最后一次漂洗液涂 PDA 培養(yǎng)基作為對照，培 養(yǎng)基密封后，28 ℃ 黑暗培養(yǎng)約 1 個月，期間定期觀察 菌絲生長情況，及時挑取菌絲純化培養(yǎng) 4 ～ 6 次，編號 并接種到 PDA 試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待培養(yǎng)基長 滿菌絲后置于冰箱 4 ℃保存，備用。

2. 2 目標菌株形態(tài)學觀察

取少量待測內生真菌菌絲點置于 PDA 培養(yǎng)基 中，倒置放于 28 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng) 6 ～ 15 d，每天定期 觀察菌落大小、質地、邊緣形態(tài)、顏色等。在菌落生長 的中后期挑取少量菌絲在光學顯微鏡下觀察記錄菌 絲、是否有橫隔及孢子的形態(tài)特征等。根據《真菌鑒 定手冊》中描述的真菌形態(tài)特征進行初步鑒定。

2. 3 目標菌株的分子鑒定

將待測菌株接種至 PD 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 7 d， 4 000 r /min 離心 20 min 收集菌絲，采用 CTAB法提取基因組 DNA，利用通用引物( 上游引物 ITS4 5'－ GGAAGTAAAAGTCGTAAGG－3'和下游引物 ITS5 5'－ TCCTCCGCTTATTGATATGC － 3') PCＲ 擴 增 5. 8S rDNA 及 18S rDNA 與 28S rDNA 之間的間隔序列，擴 增得到的內生真菌凝膠回收后進行測序，獲得的序列 在 NCBI GenBank 中進行 BLAST 同源性比對，下載相 似度較高的相關參考菌株的 ITS 序列，利用 Clustal X 1. 81 及 MEGA 5. 2 進行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定待鑒定 菌株的種屬。

2. 4 菌株發(fā)酵液的制備

從 4 ℃保存的 PDA 斜面培養(yǎng)基上挑取已分離純 化的少量目標菌絲接種到新的 PDA 培養(yǎng)基上; 28 ℃ 培養(yǎng)，待菌絲覆蓋 PDA 培養(yǎng)基表面，用直徑 5 mm 打 孔器打制 5 個圓形菌斑塊，置于含 250 mL PD 液體培 養(yǎng)液的 500 mL 三角瓶中，于 28 ℃，150 r /min 搖床振 蕩培養(yǎng) 14 d，4 000 r /min 離心 20 min，分離菌絲和發(fā) 酵液，將發(fā)酵液于 50 ℃減壓濃縮至干，得到的提取物 浸膏用純化水配制成濃度為 5 mg /mL，作為供試品溶 液，備用。

2. 5 菌株抗細菌活性的測定

采用圓紙片法對病原細菌( 大腸桿菌、金黃色葡 萄球菌、沙門氏桿菌) 進行抑菌活性試驗。取 37 ℃ 靜置培養(yǎng) 16 ～ 24 h 的供試細菌 LB 菌懸液( 濃度為 1× 10－5 ～ 1×10－6 cfu /mL) 100 μL，均勻涂布于 LB 固體培 養(yǎng)基上，放置 0. 5 h 后，將浸有待測菌株發(fā)酵液的滅 菌濾紙片貼在培養(yǎng)基上，重復 3 次，37 ℃ 培養(yǎng) 16 ～ 24 h 后觀察并測定抑菌圈直徑。

3 結果與分析

采用組織塊分離法從處于營養(yǎng)生長時期的新鮮 貓爪草植株中共分離到 23 株內生真菌。其中來源于 根 2 株，莖 9 株，葉 12 株，分別為分離菌株數量的 8. 7%、39. 1%和 52. 2%，可見內生真菌的分布有不同 的組織偏好。菌落形態(tài)和顯微結構存在較多差異 ，提示形態(tài)及分類地位具有較為豐富的多樣 性。產色素方面也存在較多差異，有產紅色素、紫色 素、白色素、灰色素及黑色素等色素類型。初步判斷 這 23 株內生真菌包括 6 株枝孢菌，5 株鐮刀菌，5 株 鏈格孢菌，3 株刺盤孢菌，1 株煙曲霉菌，1 株青霉菌 及 2 株叢梗孢菌。分離同種菌株的數量表明，枝孢菌 ( 26. 1%) 、鐮刀菌( 21. 7%) 及鏈格孢菌( 21. 7%) 是 貓爪草內生真菌的優(yōu)勢菌。

4 討論

關于藥用植物貓爪草內生真菌的分離還未見報 道，為了豐富內生真菌種類及其宿主植物的多樣性， 本研究初步選取了營養(yǎng)生長階段的栽培貓爪草植株 作為材料，分離其內生真菌。分離的內生真菌數量表 明，枝孢菌、鐮刀菌及鏈格孢菌是貓爪草內生真菌的 優(yōu)勢菌群。從抑菌活性分析，有約 1 /3 的菌株對金黃 色葡萄球菌有抑制活性，而貓爪草水提取物也可抑制 金黃色葡萄球菌，表明從貓爪草內生真菌中篩選 同貓爪草相同的抗菌活性物質的途徑是可行的。從 內生真菌抗菌種類分析，本試驗分離的 5 株鐮刀菌中 有 4 株具有不同程度的抗細菌和抗真菌作用。有人 已從喜樹( Camptotheca acuminate) 中分離到一種內生 真菌鐮刀菌具有抗癌活性，暗示貓爪草中的鐮刀 菌次生代謝物也可能具有與宿主類似的抗氧化、抗癌 等多種生理活性的潛能。



 

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